Slovenský Klub Chovateľov Ridgebackov

V súčasnosti je každý chovateľ i majiteľ krycieho psa zo všetkých strán bombardovaný neustále pribúdajúcimi ponukami na genetické testovanie. Mnohí sú zmätení.
Skutočne máme testovať svojich psov všetkými dostupnými testami, alebo je to len dobrý marketing a reklama laboratórií pre dosiahnutie čo najväčšieho zisku?
Vieme výsledky testov aj reálne využiť v chovateľskej praxi?
Nepovedie boom genetického testovania k zmenšeniu genetickej diverzity populácie len preto, že chovatelia zo strachu, aby si „nezaniesli“ do chovu nejakú neplechu budú používať v chove len „čistých“ jedincov? Len tak pre istotu?

RR je relatívne mladé a zdravé plemeno. Naši predchodcovia nevedeli nič o génoch a mutáciách v nich, ktoré môžu vyvolať vznik nejakej choroby. Neboli zaťažení rozhodovaním testovať či netestovať, ani výsledkami genetického testovania a predsa odchovávali, zdá sa zdravých ridgebackov. Čo teda máme robiť, aby sme súčasné výdobytky poznania neignorovali, ale aby sme, schovávajúc sa za výsledky genetického testovania, plemenu neublížili? Ako sa v tejto spleti informácií vyznať?
Na to, aby sme sa vedeli správne rozhodovať, mali by sme poznať základy genetiky, podstatu genetického testovania a podstatu vzniku jednotlivých chorôb, a ruka v ruke s týmito znalosťami používať zdravý rozum a cit.

Medzi ponukami na testovanie psov sa často objavuje aj tzv. DNA profil.
DNA profil, nazývaný aj genotypizácia (genotyping) alebo DNA odtlačok (DNA fingerprinting) sa používa na stanovenie unikátneho genetického profilu, ktorý je pre každého jedinca jedinečný (s výnimkou jednovaječných dvojčiat).

Napriek tomu, že jeho výsledkom nie je potvrdenie alebo vyvrátenie toho, že pes je zdravý, postihnutý alebo nosičom (carrier) nejakého ochorenia, je to test, ktorého význam dnes ešte nie je dostatočne docenený, hoci skrýva veľký potenciál a môže byť užitočným nástrojom pre udržanie genetickej diverzity a zdravia plemena.

Princíp DNA profilovania.

Psi majú 99% DNA rovnakej – tvoria ich časti DNA, tzv. exóny, ktoré obsahujú genetickú informáciu (gény). Iba 1% DNA, ktoré tvoria časti DNA neobsahujúce genetickú informáciu (tzv. intróny), je u každého individuálne. Dokonca do takej miery, že na základe jeho zloženia dokážeme rozlíšiť jedincov navzájom. Za individuálnu jedinečnosť zodpovedajú vysoko variabilné sekvencie o dĺžke 6 až 100 báz (báza = základná stavebná jednotka DNA) opakujúce sa aj tisíckrát, nazývané tandemové opakovania s variabilným počtom (variable number tandem repeats, VNTR), známe aj ako minisatelity. Tie sa využívali pri genotypizácii v minulosti.

V súčasnosti sa na genotypizáciu využívajú kratšie sekvencie, tzv. mikrosatelity - krátke tandemové opakovania (short tandem repeats, STR). Sú to úseky DNA, v ktorých sa určitá krátka sekvencia o dĺžke 2 až 6 báz – nazývaná motív alebo vzor, opakuje viac krát za sebou, t.j. tandemovo (Obr. 1).

Obr. 1: Schéma krátkej tandemovej repetície - STR
Konštantná sekvencia je prerušená viacnásobným opakovaním motívu, napríklad CATA, čím vytvára krátku tandemovú repetíciu - STR. V prvom prípade tvoria STR 4 opakovania motívu CATA, v druhom 2 opakovania a v treťom 6 opakovaní.

STR môžu mať dĺžku od 50 do 300 báz. Dĺžka STR, t.j. počet opakovaní určitého motívu je u každého individuálna a preto sú STR vhodnými markermi na identifikáciu rozdielov medzi jednotlivcami.

Pes má spolu 78 chromozómov (chromozóm = stužkový útvar v jadre bunky, ktorý tvorí kondenzovaná DNA). Všetky chromozómy v bunke, okrem pohlavných, tvoria pár, preto im hovoríme párové. Pes má teda 38 párov chromozómov + dva pohlavné chromozómy. Jeden chromozóm z páru pochádza od matky, druhý od otca. Každá STR sa teda v genóme (genóm = celá DNA = súbor chromozómov) vyskytuje dvakrát, na každom párovom chromozóme jedna kópia = alela. Počet opakovaní konkrétneho STR markera môže byť na oboch chromozómoch rovnaký (homozygot) alebo rozdielny (heterozygot)(Obr. 2).

Obr. 2: STR polymorfizmus
Polymorfizmus = viacero foriem jedného znaku. Schematické znázornenie heterozygota a homozygota v STR.

V praxi sa pri DNA genotypizácii „meria“ dĺžka STR úsekov na oboch alelách (chromozómoch) jedinca. Tá sa potom prevedie na počet opakovaní základného motívu (sekvencia základného motívu sa nestanovuje). Moderné metódy analýzy DNA umožňujú túto dĺžku merať s absolútnou presnosťou, teda s presnosťou až na jednu jedinú bázu. Automatizované zariadenia, nazývané génové analyzátory, sú schopné stanoviť dĺžku viacerých STR úsekov súčasne.

DNA profilovanie u psov.

V súčasnosti existujú vo svete dva prístupy, podľa ktorých sa robí DNA profil psov. Jedným prístupom je identifikácia STR markerov stanovených Medzinárodnou spoločnosťou pre genetiku zvierat - International society of animal genetics (ISAG). Tento prístup je odporúčaný FCI a je využívaný prevažne v Európe. ISAG panel obsahuje až 22 markerov: AHTk211, CXX279, REN169O18, INU055, REN54P11, INRA21, AHT137, REN169D01, AHTh260, AHTk253, INU005, INU030, FH2848, AHT121, FH2054, REN162C04, AHTh171, REN247M23, AHTH130, REN105L03, REN64E19, Amelogenin.

Druhým prístupom je identifikácia STR markerov stanovených Americkým klubom chovateľov – American kennel club (AKC). AKC panel obsahuje len 14 markerov: PEZ01, PEZ03, PEZ05, PEZ06, PEZ08, PEZ12, PEZ20, UCB2010, UCB2054, UCB2079, PEZ16, PEZ17, PEZ21, GEN.

Ako je na prvý pohľad zrejmé, tieto prístupy sa navzájom odlišujú nielen v počte, ale aj vo výbere (v paneli) stanovovaných markerov a nie sú vzájomne kompatibilné, čiže sa nedajú vzájomne porovnať.

Ako vyzerá výsledok DNA profilovania? Na Obr. 3 je zobrazený vzorový príklad DNA profilu psa na základe ISAG panela markerov.

Obr. 3: DNA profil psa (ISAG panel)
Zdroj: https://www.genomia.cz/cz/homepage/test_result_preview/218/?lng=cz&png=0

Čo tieto písmená a čísla vlastne znamenajú?
V kolónke „Locus name“ je uvedený názov vyšetrovaného STR markera, v kolónke „Value“ je uvedený výsledok zodpovedajúci testovanému markeru (Obr. 3). Výsledkom bývajú zvyčajne dve čísla oddelené lomítkom. Napríklad výsledok pre marker INRA21 – 95/101 znamená, že STR marker nazvaný INRA21 má u daného jedinca dve rôzne alely (v tomto markeri je jedinec heterozygot), čiže INRA21 sa vyskytuje na jednom chromozóme v 95 opakovaniach a na druhom v 101. V markeri nazvanom CXX279 je vyšetrovaný jedinec homozygot, pretože na oboch alelách (chromozómoch) má marker CXX279 dĺžku 124 (124/124).

Ak sa vo výsledku uvádza len jedno číslo, neznamená to nič negatívne pre testovaného psa, vyjadruje to len, že marker na jednej alele nebol alebo nemohol byť stanovený (väčšinou z technických príčin). V prípade markera Amelogenin sa neuvádzajú čísla, ale iba písmená X alebo Y, ktoré znamenajú pohlavie jedinca: X/X – fena, X/Y – pes.

Výpovedná hodnota genetického profilu závisí na počte sledovaných markerov a na ich vnútornej variabilite. Čím viac markerov sa sleduje, tým je menšia pravdepodobnosť, že dvaja jedinci budú mať genetický profil podobný.

Z tohto pohľadu je preto dôležitý správny výber laboratória, v ktorom si genetický profil psa objednáte. Nie všetky laboratóriá totiž vyšetrujú všetkých 22 markerov stanovených ISAG. Okrem toho je dôležité, aby sa laboratórium pravidelne zúčastňovalo porovnávacích testov kvality organizovaných ISAG a bolo držiteľom ISAG certifikátu úspešnosti. Samozrejmosťou by mala byť aj akreditácia laboratória národnými autoritami, ktorá vyjadruje to, že laboratórium dodržiava akreditované postupy a všetky metódy pravidelne preveruje a validuje. Len výsledok od takéhoto laboratória Vám zaručí, že genetický profil Vášho psa bude kvalitný a časovo neobmedzene platný.

Význam DNA profilovania.

Keďže krátke tandemové opakovania sa nachádzajú v intrónoch (nekódujú žiaden gén), ich presný biologický význam zatiaľ nepoznáme. Predpokladá sa však, že STR, aj VNTR, majú regulačnú funkciu a môžu ovplyvňovať gény umiestnené v ich blízkosti. U ľudí je napríklad známe, že rôzna dĺžka VNTR nachádzajúcich sa v oblasti pred génom (v promótore) kódujúcim inzulín súvisí s rôznymi typmi diabetu.

Ak STR nekódujú žiaden gén a ich význam nepoznáme, na čo je teda DNA profil dobrý?
V prvom rade na nezameniteľnú identifikáciu jedinca, ako doplnok k čipovaniu. DNA profil psov je v podstate forenzná metóda identifikácie jedincov, ktorá sa používa aj v kriminalistike na identifikovanie páchateľov trestných činov. Predpokladám, že psov – páchateľov trestných činov asi mnoho nebude :), avšak v živote sa môžu vyskytnúť situácie, kedy je takáto metóda identifikácie, resp. potvrdenie totožnosti jedinca veľmi prínosná aj pre majiteľa psa, napríklad:

• keď je mikročip z nejakého dôvodu nefunkčný, alebo u psa chýba – podmienkou však je, že DNA profil jedinca bol urobený ešte pred touto udalosťou, aby bolo možné nový a „starý“ DNA profil porovnať a tak potvrdiť identitu jedinca;
• keď je potrebné identifikovať stratené/ukradnuté zviera - opäť platí podmienka, že DNA profil jedinca bol urobený ešte pred touto udalosťou, aby bolo možné DNA profily hľadaného a nájdeného jedinca porovnať a tak potvrdiť ich totožnosť;
• overenie rodičovstva alebo príbuznosti jedincov - porovnávajú sa DNA profily dotknutých jedincov. Napríklad v prípadoch, keď je suka oplodnená viacerými psami – pomocou DNA profilu matky, krycích psov a šteniat je možné presne určiť, ktorý pes je otcom ktorého šteňaťa.
  Do tejto kategórie spadá aj tzv. potvrdenie „čistý/negatívny po rodičoch“ („clear by parentage“) – DNA profil musí byť stanovený u oboch rodičov aj u šteňaťa. Rodičia musia mať navyše vykonaný test potvrdzujúci, že nie sú nositeľmi mutácie spôsobujúcej konkrétne ochorenie, ktoré vyhodnocujeme – tzn. že sú „clear“ (homozygotne negatívny). V takom prípade sa potvrdzuje, že šteňa je potomkom týchto „clear“ rodičov, takže by štatisticky danú mutáciu nemalo mať. Test však explicitne nestanovuje, že šteňa danú mutáciu nemá!, preto je potrebné u šteňaťa jasne uvádzať „clear by parentage“;
• identifikácia spermy pri inseminácii a uchovávaní – využíva sa na overenie totožnosti chovného psa a používanej, resp. skladovanej spermy.

Z chovateľského hľadiska sú však zaujímavejšie iné možnosti, ktoré stanovenie DNA profilu môže ponúknuť, a o ktorých sa často nehovorí. Sú to:

1. zhodnotenie genetickej odlišnosti (diverzity = heterozygotnosti) alebo príbuznosti        (inbríding = homozygotnosti) rodičovského páru,

2. cielený výber budúcich chovných jedincov pri plánovaní individuálnych chovných línií na základe stanovenia genetickej diverzity,

3. zhodnotenie genetickej diverzity vybranej populácie (napr. chovných jedincov v konkrétnej krajine) pre uľahčenie cieleného výberu chovných jedincov a importov, s cieľom udržiavať nízku úroveň inbrídingu a zvyšovať genetickú diverzitu populácie.

Pri výbere vhodného krycieho psa sledujú chovatelia okrem exteriérových, povahových a zdravotných čŕt, aj rodokmene matiek a potenciálnych otcov svojich šteniat. Z rodokmeňa vieme s istotou „vyčítať“ posledné 4 generácie, pri hlbšom pátraní sa dokážeme dostať na úroveň -5. až -8. generácie predkov. To, nakoľko je skutočne vybraný krycí pes geneticky príbuzný s chovnou líniou chovateľa alebo nakoľko je geneticky od nej vzdialený vieme z rodokmeňa len predikovať, nie však exaktne potvrdiť. V minulosti, keď ešte nebolo dostupné DNA profilovanie, používali chovatelia na stanovenie úrovne príbuznosti, tzv. koeficient inbrídingu. Je to veľmi „hrubý“ štatistický výpočet na stanovenie miery príbuznosti = homozygotnosti chovného páru, ktorý vychádza z pozície spoločného predka v rodokmeňoch rodičovského páru. Ak na to chovatelia nemali/nemajú osobitný dôvod, snažili sa alebo sa snažia inbrídingu vyhýbať. Ak vybraný rodičovský pár spoločného predka nemal/nemá, považuje sa spojenie za outbríding – nepríbuzenské kríženie. Avšak stanovenie koeficientu inbrídingu v žiadnom prípade nemusí zohľadňovať reálnu situáciu v genóme jednotlivcov a nepríbuzenské kríženie nie vždy zabezpečí zachovanie heterozygotnosti populácie pre všetky gény alebo znaky. V populácii totiž nie je počet variácií jedného génu nekonečný. Cielenou plemenitbou, aj keď založenou na outbrídingu, postupne môže dochádzať a aj dochádza k produkcii homozygotov pre niektoré gény alebo znaky. Najmä v málo početných populáciách, bez prílivu „novej krvi“, sa nevyhnutne vyskytuje istý stupeň inbrídingu, pretože ich členovia zdieľajú minulých alebo súčasných predkov.

Ak si zakladáme na nepríbuzenskom princípe chovu a chceme zachovať, čo najväčšiu genetickú diverzitu = rôznorodosť, alebo heterozygotnosť, je veľmi vhodným pomocníkom pri výbere rodičovského páru práve stanovenie koeficientu diverzity na základe DNA profilu (k bodu 1). Nebudem tu opisovať presný výpočet tohto koeficientu, na to už existujú online nástroje s popisom, napr. tu: https://www.genomia.cz/cz/koef/. Zmienim sa len, že princípom stanovenia diverzného koeficientu je porovnanie DNA profilov chovnej suky a potenciálneho krycieho psa – jedného alebo viacerých. Vyhodnocuje sa v ňom, nakoľko sú budúci rodičia geneticky rôznorodí alebo podobní v jednotlivých markeroch DNA profilu. Výsledkom je potom komplexné číslo – koeficient diverzity, ktoré vypovedá o pravdepodobnosti, ktorý chovný pár poskytne geneticky najrôznorodejšie = najviac heterozygotné, alebo naopak najpodobnejšie = najviac homozygotné potomstvo.

Ak má chovateľ záujem sledovať svoj chov komplexne a plánuje vývoj svojej chovnej línie dopredu, môže investovať do DNA profilingu celého svojho odchovu/odchovov (k bodu 2). Výpočet diverzného koeficientu (ako je uvedené vyššie) medzi matkou, otcom a jednotlivými šteňatami a súčasné porovnanie vizuálne identifikovateľných vlastností šteniat (farba, stavba tela, povaha a pod. = fenotyp) môže chovateľovi pomôcť v rozhodovaní, ktoré zo šteniat si ponechá pre ďalší chov v závislosti od toho, čo sleduje a kam svoj chov chce posunúť – či už k čo najväčšej genetickej rôznorodosti pri zachovaní fenotypovej podobnosti alebo k budovaniu homozygotnej línie (čo je však pri súčasnom poznaní dedičnosti niektorých chorôb veľmi vratká pôda). Tento prístup k chovu je finančne náročnejší a dnes sa môže zdať, že prínos nie je adekvátny vynaloženým finančným prostriedkom. Netreba však zabúdať na to, že šťastie praje pripraveným a chovateľ, ktorý pozná okrem fenotypu aj DNA profily svojho chovu, si môže dovoliť občas aj zaexperimentovať s líniovou plemenitbou a nakoniec bude lepšie pripravený využívať nové nástroje a možnosti, ktoré nám denno-denne pokrok v molekulárnej genetike prináša. Na tomto mieste je dôležité upozorniť, že tento prístup cieleného výberu budúcich chovných jedincov v rámci budovania individuálnej chovnej línie na základe DNA profilingu by mali využívať len skúsení chovatelia, ktorí sa vyznajú v genetike a sú schopní používať tento cielený výber s mierou, ako pomocnú metódu a doplnok k chovateľskému citu. Neznalosť problematiky a zneužívanie moderných nástrojov genetiky môže totiž viac uškodiť ako pomôcť.

V súčasnosti je možné sledovať genetickú diverzitu celej populácie, napríklad chov v jednotlivých krajinách (k bodu 3). Niektoré chovateľské kluby v Západnej Európe už dnes vyžadujú u chovných jedincov zhotovenie DNA profilu, hoci zatiaľ iba ako jednoznačného identifikátora. Tým si však budujú neoceniteľnú databázu informácií o genetickom zložení svojej populácie, ktorá už dnes môže poskytnúť veľké množstvo údajov o populačnej genetike plemena a smerovaní chovu. Už dnes sú dostupné nástroje a počítačové analýzy, ktoré pomocou vyhodnotenia DNA profilov dokážu porovnať genetickú podobnosť konkrétneho jedinca s inými jedincami nachádzajúcimi sa v databáze a graficky zobraziť genetickú rôznorodosť celej populácie. Veľmi pekným nástrojom na sledovanie diverzity a príbuznosti RR v rámci populácie je softvér spoločnosti MyDogDNA (Obr. 4). Dokáže vyhodnotiť a zobraziť genetickú príbuznosť konkrétneho jedinca v porovnaní s celou testovanou populáciou RR. MyDogDNA umožňuje vyselektovať jedincov podľa krajín a zobraziť tak vzájomnú genetickú príbuznosť populácie v jednotlivých krajinách, alebo porovnať populácie jednotlivých krajín navzájom a pod.. To umožňuje chovateľom rýchlejšiu a efektívnejšiu identifikáciu geneticky odlišných jedincov a krvných línií od jeho vlastnej chovnej základne.

O dôležitosti nielen sledovania, ale aj vedomého budovania diverzity (heterozygotnosti) RR hovorí aj fakt, že podľa údajov obsiahnutých v MyDogDNA databáze je heterozygotnosť u RR aktuálne 35.6%-ná, čo je iba mierne nad priemerom v porovnaní s ostatnými plemenami - 34.7%.

Zaujímavou novinkou v tejto databáze, ktorá potvrdzuje vysoký potenciál využitia DNA profilingu, je analýza genetických profilov v korelácii s výškou a váhou ridgebackov. Je zaujímavé, že hoci ešte nebolo exaktne potvrdené, že „prerastenosť“ je dedičná a nepoznáme ani gén/gény, ktoré sú za ňu zodpovedné, z výsledkov DNA profilov je zjavné, že „prerastené“ jedince sú si v niektorých konkrétnych STR markeroch podobné.

Obr. 4: Genetická príbuznosť RR vyhodnotená na základe DNA profilov.
Zdroj:https://www.mydogdna.com/crm/index.html#en/breeds/519248a83cd390a05200012a/rhodesian_ridgeback/relationships

Čo povedať na záver? Ak znova zopakujem otázku: Čo teda máme robiť, aby sme súčasné výdobytky poznania neignorovali, ale aby sme, schovávajúc sa za výsledky genetického testovania, plemenu neublížili? Odpoveď bude, ako už bolo spomenuté v úvode, jednoduchá: učme sa základy genetiky, poznajme podstatu genetického testovania a podstatu vzniku jednotlivých chorôb, zdieľajme informácie a ruka v ruke s týmito znalosťami používajme zdravý rozum a cit. Ale je vhodné aj dodať, že: nemusíme bezhlavo vynakladať financie na všetky dostupné testy, stále totiž nepokrývajú celú paletu možných chorôb. Neignorujme ich však a rozumne si vyberajme tie, ktoré odhaľujú choroby dokázateľne dôležité pre zdravie RR a chov. Čo je však skutočne dôležité, to je nezabúdať na zachovanie diverzity – heterozygotnosti, pretože vylúčením netestovaných psov alebo bezpríznakových nosičov (carrier) z chovu nakoniec môžeme neuváženým používaním „spoľahlivých“ krycích psov vyprodukovať homozygotnú populáciu, v ktorej sa môžu objaviť oveľa závažnejšie zdravotné problémy, aké dnes testujeme a „eliminujeme“ a cesta späť môže byť skoro nemožná!

Literatúra:

• Chambers GK, Curtis C, Millar CD, Huynen L, Lambert DM. DNA fingerprinting in zoology: past, present, future. Investig Genet. 5 (1), 3, 2014. doi: 10.1186/2041-2223-5-3.
• Pastoráková A, Petrovič R: Molekulárne metódy aktuálne používané v klinickej genetike. Lekárska fakulta UK Bratislava, ISBN 978-80-223-4231-5.
• https://breedingbusiness.com/dna-profiling-and-parentage-analysis/
• http://www.animalnetwork.com.au/dnatesting/benefits.php
• http://www.animalgenetics.us/Canine/DNA-typing/DNA_Typing_Index.asp
• https://www.genomia.cz/cz/test/dog-dna-profile
• http://www.mydogdna.com/blog/dna-based-testing-most-powerful-tool-disease-management-battle-against-genetic-disorders-also
• Wade CM: Inbreeding and genetic diversity in dogs: Results from DNA analysis. The Veterinary Journal 2011, 189 (2), 183-188. doi.org/10.1016/j.tvjl.2011.06.017
• Understanding Your AKC® Profile. ©2010 The American Kennel Club, Inc. www.akc.org
• Rules for conducting ISAG Comparison Tests (CT) for animal DNA testing. International Society for Animal Genetics. www.isag.us/docs/Rules_CT.pdf?v2

Slovníček pojmov:

Spracovala RNDr. Ingeborg Režuchová, PhD
www.coffie.sk